常用的几种PCR方法的策略（二）
直接 PCR
直接PCR是指直接从样品扩增目标DNA，无需进行核酸分离纯化。直接PCR中，在高温变性阶段，诸如细胞、组织等材料在
特殊的缓冲液中被裂解，释放出DNA。因此这种方法简化了实验流程，减少了动手操作时间，同时可避免纯化步骤DNA的损
失。
图 .常规PCR和直接PCR对比。
推荐使用具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR扩增。细胞碎片、蛋白、脂质和多糖也随DNA一起被释放到裂解液中，
它们会抑制PCR反应。而具有高合成能力的DNA聚合酶能够耐受这类抑制剂，使直接PCR扩增成为可能。具有高合成能力的
酶通常具有更高的灵敏度，因此可从未纯化的样品中成功扩增微量DNA。
高GC含量PCR
具有高GC含量（>65%）的DNA模板由于G和C碱基间的强氢键影响，比较难以扩增。富含GC的序列同时也涉及二级结构。
因此，富含GC的序列可导致DNA聚合酶沿模板扩增时“卡顿”并干扰DNA合成。
为了扩增高GC含量的片段，双链模板必须解离，以便引物与模板结合，并使DNA聚合酶能够读取到序列。为了克服强GC相
互作用，最常用的方法是使用DMSO等PCR添加剂或辅助溶剂来帮助DNA变性。然而，这些试剂通常会降低引物的 Tm，所
以退火温度也需进行相应的调整。
高合成能力的DNA聚合酶由于与模板的结合能力更强，有利于完成高GC含量PCR。超高热稳定性DNA聚合酶也有利于高GC
含量PCR，因为较高的变性温度（如，使用98°C代替95°C）可能会促进双链解离和PCR扩增。
多重 PCR
多重PCR可在同一PCR反应管中同时扩增多个不同的片段。多种PCR不仅意味着节省时间、试剂和样品，还能够同时对比多
个扩增子。
当一个PCR管中有多个引物对时，如在多重PCR中，因无法仅针对一个引物对或目的片段进行反应优化，而是要考虑到所有
引物和靶标，所以可能会出现非特异性扩增和效率降低。因此，为尽量减少由非特异性扩增导致的错配，应对引物进行精心
设计。
首先，引物序列应尽可能与其目的序列一一对应，并且所有引物的 Tm相差不应超过5°C。在多重PCR开始前，应利用单个
PCR反应验证每个引物对的特异性和扩增效率。
此外，扩增子应具有不同的大小，从而能够通过凝胶电泳对其进行分离鉴定。除了引物设计和扩增子大小，使用热启动DNA
聚合酶和专为多重PCR设计的缓冲液也将有助于获得成功的PCR结果和提高反应特异性。
尽管多重PCR常作为终点法PCR，但由于其在多重标记和检测中的能力 ，将其用于实时荧光定量PCR也变得越来越流行。另
外，多重实时荧光定量PCR也常被用于遗传标志物的检测，用于人类身份鉴定。